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              認識熒光定量PCR儀的兩個誤區
              點擊次數:568 發布時間:2021-03-24
                 認識熒光定量PCR儀的兩個誤區:
                誤區一:儀器通道越多越好
                隨著PCR技術的成熟運用,多重擴增越來越熱鬧,熒光定量PCR儀也不能幸免。
                在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時,為了確保實驗結果的準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或Referencedye,這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來,真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的熒光染料或試劑開放的,有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要,不能單單只聽宣傳。
                考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發,多重PCR并非人人適用、人人可用,因為它使實驗復雜化了。
                誤區二:熒光定量PCR儀無需梯度功能
                對于使用染料法的定量PCR反應,雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm值),但運用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化,對于特殊片斷,經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果,退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內按照梯度變化,根據結果,一步就可以摸索出適合的反應條件。
                不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要,因為Taq和校正酶的反應溫度可能有顯著差異,優化延伸溫度就顯得很重要。
                使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程,簡化了摸索PCR反應條件的繁瑣實驗,既節省實驗時間提高效率,又節省實驗成本。

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